El prototipo entro en servicio con American Airlines en Julio 11 de 1936, a partir de ahi gran cantidad de aerolineas comerciales incorporaron unidades a su flota, se dieron licencias de fabricacion al Japon y Rusia, la cual lo construyo como PS-84 y Linusov Li-2. Al estallar la Segunda Guerra Mundial los DC-3 civiles fueron requisados por las fuerzas militares, demostrando una gran versatilidad en el apoyo del esfuerzo de guerra.En Estados Unidos el Mando de Transporte aereo adquirio 545 unidades en 1940, que fueron bautizadas C-47 Skytrain, para 1941 se solicitaron 70 C-47 y 100 C-53 version de pasajeros para la US Army. El C-47 diferia del DC-3 en el piso de la cabina reforzado, puertas de carga mas amplias y motores Pratt&Withney de 1200 hp; se le instalaron asientos laterales y se abrieron troneras para poder utilizar armas portatiles en combate. Posteriormente se desarrollo la version C-47B impulsada por dos motores Dash-90B con sobrecompresores y gasolina extra para poder sobrepasar el Himalaya en las campañas de  China, Birmania e India.
 

El 1942 se constituyo el Mando de Transporte de Tropas de los Estados Unidos asumiendo el C-47 el papel de remolque de planeadores y transporte de paracaidistas.En la RAF el C-47 fue denominado Dakota, correspondiendose el Dakota I con el C-47, el Dakota II con el C-53, el Dakota III con el C-47A y el Dakota IV con el C-47B. En total sirvieron con la RAF unos 1895 aviones desde 1942 hasta 1950. En la US Navy el C-47 sirvio como R4D. En esta la principal variante de carga era la R4D-5 con motores Dash-92, sistema electrico de 24 voltios correspondiendose con el C-47A. Despues de Pearl Harbor se creo el Servicio Aereo Naval de Tranporte equipado exclusivamente con R4D dedicandose al transporte de personal naval y del USMC Cuerpo de Marina de los USA. Mas tarde fue utilizado por los paracaidistas del USMC. La Douglas a solicitud de la US Navy desarrollo la version R4D-8, como una modernizacion del DC-3 en un Super DC-3, con alas angulares aflechadas, fuselaje alargado y reforzado, deriva aumentada, motores R-1820-80 sobrepotenciados y gondolas mas profundas. Se convirtieron 98 unidades para misiones invernales R4D-8L, entrenador R4D-8T, R4D-8Z transporte del Estado Mayor.Durante la Guerra de Corea, la USAF lo utilizo para el suministro y lanzamiento de fuerzas paracaidistas, mientras que su version RC-47D fue utilizada para el lanzamiento de bengalas en operaciones nocturnas. En 1953 se modificaron 26 AC-47D para tareas de ayuda en la navegacion aerea.

La US Navy utilizo gran cantidad de R4D para tareas electronicas especializadas, añadiendoles radomos en la proa y ventrales , antenas en el fuselaje, deriva y techo de la cabina, utilizandolos como entrenadores de guerra electronica naval. Durante la Guerra de Vietnam entre 1965 y 1972 se le acoplaron a traves de las puertas de carga tres ametralladoras de tiro lateral rapido Minigun de 7,62mm  con los cuales saturaban los objetivos en la jungla. El DC-3 en su version comercial ha sido utilizado en gran cantidad de paises de todos los continentes, muchos de ellos continuan volando en lineas comerciales de segundo orden, mas de 60 años despues de haber sido volado el primero.